美罗华(利妥昔单抗，Rituximab)是一种靶向CD20阳性B细胞的单克隆抗体，广泛应用于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等血液系统疾病的治疗。美罗华ELISA试剂盒作为定量检测血清、血浆或其他生物样本中美罗华浓度的核心工具，其检测结果的准确性直接影响疗效评估与用药方案调整。实现标准化检测，需从样本类型选择、预处理规范到检测流程全链路把控。
一、样本类型：
1.血清：较常用的样本类型，通过静脉采血后静置30-60分钟(或离心1000-2000rpm，10-15分钟)，分离上层淡黄色透明液体。血清中无抗凝剂干扰，抗体稳定性高(4℃可保存3天，-20℃长期保存6个月)，适用于常规治疗监测。
2.血浆：采用EDTA、肝素或枸橼酸钠抗凝管采血(避免使用草酸盐抗凝剂，可能干扰抗原-抗体结合)，离心条件与血清相同。血浆样本需尽快检测(24小时内)，若需长期保存，需分装后-80℃冷冻(反复冻融会导致抗体降解)。
3.其他特殊样本：部分试剂盒经验证后可检测脑脊液(需离心去除细胞碎片)、细胞培养上清液(检测药物分泌浓度)等，但需严格参照说明书调整稀释倍数(通常需1:10-1:100稀释以降低基质干扰)。
二、预处理步骤：
1.样本收集：静脉采血时需规范操作(止血带使用时间≤1分钟，避免溶血)，血清/血浆分离后立即转移至无RNA酶/DNA酶的离心管(防止样本污染)。
2.离心规范：血清样本离心转速建议1500-2000rpm(对应相对离心力约400-500×g)，血浆样本因抗凝剂差异可能需调整至1000-1500rpm(避免抗凝剂沉淀影响检测)。离心后取上清液(避免吸取下层细胞残渣或脂血层)。
3.稀释与过滤：若样本中美罗华浓度预期过高(如接近试剂盒检测上限)，需用试剂盒配套的稀释液(通常为PBS缓冲液，pH7.2-7.4)进行梯度稀释(如1:10、1:100)，稀释后需充分混匀(涡旋震荡10-15秒)。对于脂血或黄疸样本(可能干扰比色检测)，可通过0.22μm滤膜过滤去除脂质颗粒或胆红素(需验证过滤是否影响抗体活性)。
4.储存条件：预处理后的样本若不立即检测，需根据类型分类保存——血清/血浆4℃短期保存(≤3天)，长期保存需-20℃(≤1个月)或-80℃(≤6个月)，且避免反复冻融(较多不超过3次)。
三、检测流程标准化：
1.试剂准备：将试剂盒中的捕获抗体(包被于微孔板)、检测抗体(标记酶，如辣根过氧化物酶HRP)、标准品(已知浓度的美罗华溶液)、底物溶液等提前平衡至室温(20-25℃，30分钟)，避免温度差异导致结合效率波动。标准品需按说明书梯度稀释(如0、1、5、10、20、50μg/mL)，建立浓度-吸光度标准曲线。
2.加样与孵育：按顺序向微孔板中依次加入标准品、待测样本(每孔100μL)，每个样本设置复孔(至少2孔)，减少操作误差。37℃孵育60-90分钟(或4℃过夜)，使美罗华与包被抗体充分结合。孵育后甩干孔内液体(拍打或离心辅助)，用洗涤液(含0.05%Tween-20的PBS)洗涤3-5次(每次浸泡1-2分钟，避免残留物干扰)。
3.信号检测：加入酶标记的检测抗体(每孔100μL)，37℃孵育30-60分钟，形成“包被抗体-美罗华-检测抗体”复合物；再次洗涤后，加入底物溶液(如TMB显色液)，避光反应10-15分钟(显色强度与美罗华浓度成正比)；较后加入终止液(如1M硫酸)，终止反应并使颜色稳定。
4.数据分析：用酶标仪在450nm波长(参比波长630nm校正背景)读取各孔吸光度值，通过配套软件拟合标准曲线(通常为四参数Logistic曲线)，计算待测样本中美罗华的浓度(单位：μg/mL或ng/mL)。结果需结合患者体重、给药剂量及治疗时间综合解读(如治疗第15天的血药浓度应达到有效治疗窗30-100μg/mL)。
美罗华ELISA试剂盒的标准化检测，是“样本适配性+预处理规范性+流程严谨性”的系统工程。通过严格遵循样本类型选择、预处理步骤及检测流程的标准化要求，可确保检测结果的准确性、重复性与临床可解释性，为美罗华的个体化用药与疗效监测提供可靠的技术支撑。
